SUBPROGRAMA DE DIAGNÓSTICO POR CITOMETRIA
SUBPROGRAMA DE DIAGNÓSTICO POR CITOMETRIA
Subcordinador: Dr A Orfao, CIC, Salamanca
- Justificación del subprograma
En la última década los análisis multiparamétricos por citometría de flujo han adquirido un importante desarrollo metodológico, a la vez que han ampliado el ya extenso abanico de aplicaciones en el diagnóstico inicial, la clasificación, evaluación pronóstica y monitorización de hemopatías malignas. Aunque tradicionalmente se han incluido como grandes beneficiarios de esta aproximación diagnóstica, fundamentalmente las leucemias agudas y los síndromes linfoproliferativos crónicos leucemizados, más recientemente se viene reconociendo la utilidad de este tipo de análisis diagnósticos en los linfomas, los síndromes mielodisplásicos y, en menor medida también, algunos subtipos de síndromes mieloproliferativos y tumores sólidos. Su utilidad viene reflejada en la inclusión de un número creciente de indicaciones y criterios fenotípicos en las clasificaciones más utilizadas de estas entidades y la utilización de estas técnicas diagnósticas en el contexto de los protocolos terapéuticos más recientes.
En paralelo, los avances metodológicos ocurridos en los últimos años, encaminados a permitir el análisis cuantitativo en células individuales de los patrones de expresión de un número infinito de proteínas, hace augurar un papel creciente de la citometría en el diagnóstico, la caracterización y monitorización de un número cada vez mayor de procesos tumorales. Así mismo, la capacidad de aislar de forma rápida poblaciones puras de células de interés presentes en una muestra, hace que en paralelo y de forma progresiva, la citometría se venga convirtiendo en los últimos años en un método de gran utilidad para la preparación de muestras idóneas donde aplicar técnicas de diagnóstico genético/genómico y molecular.
No obstante, estos avances no han ido asociados a una comprensión clara de su significado y beneficios y, derivado de ello, de un esfuerzo adecuado por facilitar su implementación, difusión y actualización constantes, encontrándonos con frecuencia en su aplicación a la práctica diagnóstica diaria, con la ausencia de protocolos estandarizados, la aplicación de criterios y procedimientos obsoletos y escasas posibilidades de formación.
2.- Objetivos
El objetivo general de esta plataforma de diagnóstico consiste en crear y ofertar a los distintos grupos de investigación que participan en esta red, un servicio de apoyo al diagnóstico, caracterización y monitorización de los distintos subtipos de hemopatías y algunos tumores sólidos, fundamentado en el empleo de técnicas de citometría de flujo. Para ello, nos proponemos desarrollar y alcanzar los siguientes objetivos específicos.
a) Definir las indicaciones de este tipo de estudios en el diagnóstico y la monitorización de leucemias agudas, síndromes linfoproliferativos crónicos y linfomas, síndromes mielodisplásicos, síndromes mieloproliferativos y gammapatías monoclonales.
b) Definir y establecer paneles, protocolos y algoritmos consensuados para la caracterización diagnóstica, la evaluación pronostica y la monitorización de los grupos de neoplasias referidas en el objetivo anterior.
c) Diseñar e implantar programas internos y externos de control de calidad en relación con los protocolos anteriores.
d) Crear un catálogo de servicios para la caracterización y asesoramiento sobre casos especiales.
e) Desarrollar, difundir e implementar nuevos avances, métodos y criterios útiles para el diagnóstico caracterización y monitorización de enfermedades neoplásicas por citometria.
3.- SERVICIOS, TÉCNICAS Y METODOLOGÍA
Esta plataforma se centra fundamentalmente en la utilización de técnicas de análisis y separación de células y productos celulares por citometría. Incluye así mismo, técnicas de inmunofluorescencia, de fluorescencia con distintos fluorocromos específicos de distintos componentes y funciones celulares y técnicas de inmunoanálisis fluorescente sobre matrices de esferas. Para el análisis de los revelados fluorescentes se empleará citometría de flujo de hasta entre 10 y 11 parámetros distintos y funciones separadoras en al menos cuatro vías paralelas (separación simultánea de cuatro subpoblaciones celulares) a alta velocidad (>20.000 células/segundo). Así mismo, se utilizarán herramientas informáticas específicas incluidas herramientas para reconstrucción de espacios multidimensionales que generen matrices con un número infinito de parámetros por célula.
4.- ESTRUCTURA, GRUPOS Y EXPERIENCIA
Centro de Investigación del Cancer (CIC) Salamanca
Subcordiandor Alberto Orfao
Hospital Clinico de Salmanca
Investigador: Jesús San Miguel
Hospital 12 de Octubre de Madrid
Investigador Juan José Lahuerta,
El grupo de Alberto Orfao junto al de Jesus San Miguel, tienen demostrada experiencia en el diagnóstico de hemopatías malignas por citometría con una participación e intervenciones destacadas a nivel internacional en relación con el desarrollo, identificación y aplicación de nuevas estrategias de diagnóstico, caracterización y monitorización de hemopatías malignas por citometría. Así, merece destacar la participación de Alberto Orfao en: 1) la propuesta de clasificación inmunofenotipica de leucemias agudas del grupo europeo EGIL, adoptada por la OMS en su propuesta actual de clasificación de estas entidades, 2) la coordinación entre los años 1994-1997 del comité de estandarización en citometria clínica de la IFCC (International Federation of Clinical Chemistry; Orfao et al, Clin Chemistry, 1999), 3) la co-autoria del documento H42A del CLSI de EEUU (anteriormente NCCLS o National Committee for Clinical and Laboratory Standards), 4) la participación en el grupo Europeo de Consenso en Mastocitosis (Valent et al, sometido a publicación) y la red española de mastocitosis (Orfao et al, Clin Cytometry, 2004), 5) en el European Myeloma Network (Rawstron et al, sometido a publicación) y más recientemente, 6) en el US/European Working group on myelodysplastic syndromes (Viena, Julio de 2006) coordinado el comité de estandarización en citometria y 7) en la elaboración de las recomendaciones de estos grupos en relación con la utilidad diagnóstica de la citometria en diferentes hemopatías. Además es coautor de las recomendaciones de las dos conferencias latinoamericanas de consenso en el diagnóstico de hemopatías malignas (Clin Cytometry, 1997 y Clin Cytometry, 2006). Así mismo, este grupo junto al grupo de Jesús San Miguel son miembros de la European Leukemia Net y del European Myeloma Network y coordinan sendas unidades de diagnóstico inmunofenotípico en la Universidad de Salamanca (Centro de Investigación del Cáncer) y el Hospital Universitario de Salamanca, respectivamente, con una trayectoria en este area de más de 15 años. A su vez, dentro de la anterior Red de mieloma del ISCIII, ambos grupos junto al grupo de Juan José Lahuerta han estructurado un servicio de apoyo al diagnóstico y monitorización de enfermedad mínima residual en mieloma múltiple, abierta a distintos grupos, incluidos los grupos cooperativos PETHEMA y GEM (grupo español de mieloma).
5.- PLAN DE TRABAJO
.En relación al primer objetivo, proponemos:
a) Elaborar un documento donde se recojan de forma justificada y razonada las indicaciones médicas de los estudios de citometría en diagnóstico y la monitorización de leucemias agudas, síndromes linfoproliferativos crónicos y linfomas, síndromes mielodisplásicos, síndromes mieloproliferativos y gammapatías monoclonales (meses:1-12 y actualización posterior siempre que se considere oportuno).
b) Difundir a través de la página web de la red aquellos documentos de consenso actualizados y relevantes en relación con las indicaciones antes referidas (meses: 1-3 y actualización posterior durante los meses 4 a 48).
En relación con el segundo objetivo, proponemos:
a) Elaborar protocolos y paneles de consenso para la caracterización diagnóstica, la evaluación pronostica y la monitorización de los grupos de neoplasias referidas en el apartado anterior (meses: 1-48)
b) Recoger los protocolos anteriores en documentos que puedan ser distribuidos y sean accesibles a los grupos de la red a través de la página web (meses: 6-48).
c) Organizar reuniones/talleres donde se discutan y difundan dichos protocolos (1 taller/año: meses, 12, 24, 36 y 48)
En relación con el tercer objetivo, el plan de trabajo incluye:
a) Elaboración de un protocolo consensuado de control de calidad interno y difundir documentos a través de la página web en relación con este aspecto (meses: 1-6).
b) Puesta en marcha un programa de control de calidad externo de citometria en el diagnóstico de los distintos subtipos de hemopatías. (meses: 12-48)
En relación con el cuarto objetivo, proponemos:
a) Elaborar un catálogo de servicios que incluya: 1) estudios completos de diagnóstico y monitorización de distintos subtipos de hemopatías malignas referidas, 2) asesoramiento diagnóstico e interpretación centralizada de datos de citometria y, 3) establecimiento de una red de separación celular a nivel de unidades de referencia (meses: 1-6 y actualización posterior)
b) Establecer dicha red de servicios y ofertar los mismos a los grupos de investigación de la red (meses: 6-48).
c) Crear una unidad de apoyo a estudios diagnósticos de citometria en tumores sólidos (meses: 3-48)
d) Establecer e implementar un programa de movilidad de personal de los distintos grupos de la red para el entrenamiento y perfeccionamiento en técnicas de citometria (meses: 3-48).
En relación con el quinto objetivo, proponemos:
a) Difundir a través de la página web y de los talleres realizados en relación con los objetivos anteriores, nuevos avances, métodos y criterios útiles para el diagnóstico caracterización y monitorización de enfermedades neoplásicas por citometria (meses: 6-48).
Bibliografia relevante:
1. Ruiz Arguelles A, et al: Report on the second Latin American Consensus Conference for Flow Cytometric Immunophenotyping of Hematological Malignancies. Cytometry, 70B: 39-44, 2006.
2. Cruz I, et al Evaluation of multiparameter flow cytometry for the detection of breast cancer tumor cells in blood samples. American Journal of Clinical Pathology, 123: 66-74, 2005.
3. Lima M,et al: Immunophenotypic analysis of TCR Vbeta repertoire in 98 persistent expansions of CD3+/TCRalfa-beta+ large granular lymphocytes: utility in assessing clonality and insights into the pathogenesis of the disease. Am J Pathol, 159: 1861-1868, 2001.
4. Orfao A, et al for the Standardization Committee on Clinical Flow Cytometry of the International Federation of Clinical Chemistry: Clinically useful information provided by the flow cytometric immunophenotyping of hematological malignancies: current status and future directions. Clinical Chemistry, 45: 1708-1717, 1999.
5. Orfao A, et al: Immunophenotyping of acute leukemias and myelodysplastic syndromes . Cytometry, 58A: 62-71, 2004.
6. Sanchez ML, et al: Incidence of phenotypic aberrations in a series of 467 patients with B chronic lymphoproliferative disorders: basis for the design of specific four-color stainings to be used for minimal residual disease investigation. Leukemia, 16: 1460-1469, 2002.
7. Szczepanski T, Orfao A, Van Der Velden Vh, San Miguel Jf, Van Dongen Jjm: Minimal residual disease in leukaemia patients. Lancet Oncology, 2: 409-417, 2001.
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