SUBPROGRAMA DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN NEOPLASIAS HEMATOLOGIAS

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SUBPROGRAMA DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR EN NEOPLASIAS HEMATOLOGIAS

Subcordinadora: Dra D Colomer, IDIBAPS1. Justificación del subprograma

Las nuevas herramientas de diagnóstico molecular son imprescindibles para la correcta evaluación y diagnóstico de linfomas y leucemias. Para ello es necesaria la puesta a punto y estandarización de técnicas de Biología Molecular que son imprescindibles en el estudio de diferentes neoplasias hematológicas. El desarrollo de técnicas de biología molecular, como la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), ha tenido un gran impacto en el diagnóstico hematológico. Las técnicas de PCR y todas sus variantes (Retrotranscripción y PCR (RT-PCR) y PCR cuantitativa) se pueden utilizar en todo tipo de muestras, incluyendo a muestras fijadas e incluidas en parafina. En la actualidad muchos de las pruebas diagnósticas hematológicas son indispensables para el diagnostico de una hemopatía (gen PML-RARa y mutaciones de JAK-2) o para evaluar la respuesta a fármacos dirigidos específicamente hacia la alteración genética que causa la neoplasia, como ocurre en la detección del gen Bcr-abl en la leucemia mieloide crónica. Los avances en la caracterización de nuevos alteraciones moleculares y el desarrollo de nuevos métodos de diagnóstico molecular requiere la coordinación de esfuerzos entre los diferentes centros españoles implicados en el diagnostico y seguimiento de la enfermedad residual en leucemias y linfomas.

2. Objetivos 1.- Favorecer la coordinación entre los laboratorios de diagnóstico molecular de neoplasias linfoides. Para ello se propone:1.1. Proporcionar a los centros españoles de una cartera de servicios, para que cualquier centro sepa donde se realiza una prueba determinada.1.2. Desarrollo de protocolos para la realización de las técnicas de biología molecular. 1.3. Estandarización de las técnicas moleculares más comunes en los laboratorios de biología molecular1.4. Designar centros de referencia para cada una de las técnicas a desarrollar.1.5. Participar en la implementación de técnicas de nueva creación.1.6. Potenciar los programas de control de calidad existentes en el grupo de Biología Molecular de la Asociación Española de Hematologia y Hemoterapia (AEHH) y promover la introducción de nuevas técnicas en este programa.1.7. Promover la realización de cursos de actualización de las técnicas de biología molecular.

2. Proporcionar servicio de análisis molecular a todos los grupos de la red. La plataforma estará disponible para cualquier investigador de la red de cáncer que lo requiriera, tanto directamente como indirectamente (a través de colaboraciones de investigación), si su proyecto incluye aspectos de diagnóstico molecular.

3. Servicios, Técnicas y Metodología

Los servicios que se ofrecen a los distintos grupos de la red de cáncer son:

1. Extracción de ADN de muestras de sangre periférica, médula ósea, material fijado e incluido en parafina y material congelado.2. Extracción de ARN de muestras de sangre periférica, médula ósea, material fijado e incluido en parafina y material congelado.3. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 4. PCR-alelo especifica para el análisis de mutaciones específicas 5. Retrotranscripción y PCR (RT-PCR) para el análisis de genes de fusión. 6. PCR cuantitativa (PCR a tiempo real) para el análisis de expresión de genes y detección de enfermedad mínima residual7. Análisis de productos de PCR en un secuenciador y análisis mediante GeneScan, para el análisis de clonalidades8. Análisis de microsatélites para el estudio de quimerismo después del trasplante9. Secuenciación para el análisis de mutaciones

Relación de los técnicas disponibles:

• Reordenamiento del gen IGH (análisis de la región FR1, FR2 y FR3 de la cadena pesada de las Inmunoglobulinas)
• Reordenamiento del gen TCRG
• Reordenamiento del gen TCRB
• Hipermutaciones de las Ig
• Gen de fusión BCR-ABL correspondiente a la t(9;22) mediante RT-PCR
• Gen de fusión PML-RARA correspondiente a la t(15;17) mediante RT-PCR
• Gen de fusión MYH11-CBFB correspondiente a la inv(16) y t(16;16) mediante RT-PCR
• Gen de fusión RUNX-RUNX1 correspondiente a la t(8;21) mediante RT-PCR
• Gen de fusión MYST3-CREBBP correspondiente a la t(8;16) mediante RT-PCR
• Gen de fusión FIP1L1-PDGFRa correspondiente a una deleción intersticial en 4q12 en los síndromes hipereosinofilicos
• Otros genes de fusión en leucemias agudas menos frecuentes
• Mutación JAK-2 (V617F)
• Mutaciones en FLT-3
• Mutaciones en nucleofosmina (NPM1)
• Mutaciones gen BCR-ABL
• Reordenamiento IgH-BCL1 mediante PCR en el linfoma de células del mantolinfoma del manto
• Reordenamiento IgH-BCL2 mediante PCR en el linfoma folicularlinfoma folicularDeterminación de mutaciones en la cadena pesada de las Inmunoglobulinas
• Cuantificación de la enfermedad mínima residual mediante la detección del gen Bcr-Abl mediante PCR cuantitativa
• Cuantificación de la enfermedad mínima residual en leucemias que presentan las traslocaciones más frecuentes (PML-RARa, RUNX-RUNX1, MYH11-CBFB)

Hospital Clínic de Barcelona, Subcordinadora: D Colomer

Hospital Clínico de Salamanca/CIC, Investigador: M Gonzalez asociado al grupo de J Sanmiguel

Hospital Sant Pau de Barcelona Investigador: Dr J Nomdedeu

Hospital La Fe de Valencia Investigador: P.Bolufer asociado al grupo de Dr MA Sanz

CNIO de Madrid Investigador: MA Piris

MD Anderson, Madrid Investigador: J Fernandez-Garcia

La plataforma de diagnóstico molecular hematológico está compuesta por seis grupos con una gran experiencia en el área de diagnóstico molecular de neoplasias hematológicas. Debido a la gran utilidad que tienen las técnicas de biología molecular en el diagnóstico y seguimiento de las leucemias y linfomas es necesaria una acción concertada para el desarrollo de estas técnicas y para su estandarización. Para ello se dispone de la información desarrollada por el grupo BIOMED que ha proporcionado protocolos para las técnicas básicas necesarias tanto para el análisis de las traslocaciones cromosómicas más frecuentes en leucemias y linfomas como para los estudios de clonalidad. Los componentes del grupo colaboran conjuntamente en el proceso de puesta a punto y de estandarizacion de las técnicas de biología molecular en el diagnóstico hematológico. Todos los grupos tienen numerosas publicaciones científicas al respecto y algunas de ellas conjuntas. Además, participan en proyectos de investigación relacionados con este campo, han colaborado en los estudios moleculares de ensayos clínicos a nivel nacional, y han promovido la propuesta y realización de controles de calidad en laboratorios que realizan diagnóstico hematológico, lo que garantiza la capacidad investigadora del grupo y la viabilidad de la actividad propuesta.

Los centros de referencia están distribuidos por tipo de hemopatia:

· Técnicas de biología molecular empleadas en el diagnóstico de linfomas y síndromes linfoproliferativos (clonalidad linfoide, hipermutación de Innumoglobulinas, reordenamientos genéticos en linfomas): Hospital Clínic de Barcelona, Hospital Clínico de Salamanca, CNIO y MD Anderson en Madrid.

· Técnicas de biología molecular para el diagnóstico de las leucemias agudas :Hospital La Fe de Valencia, y Hospital Sant Pau de Barcelona.

· Análisis molecular de los síndromes mieloproliferativos crónicos: Hospital Clínic de Barcelona, Hospital Clínico de Salamanca/CIC, y Hospital de Sant Pau de Barcelona

· Detección de enfermedad mínima residual: Hospital Clínic de Barcelona, Hospital Clínico de Salamanca/CIC, CNIO

5. Bibliografía 1. van Dongen JJ, et al Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia. 1999 Dec;13(12):1901-28. 2. van Dongen JJ, et al Design and standardization of PCR primers and protocols for detection of clonal immunoglobulin and T-cell receptor gene recombinations in suspect lymphoproliferations: report of the BIOMED-2 Concerted Action BMH4-CT98-3936. Leukemia. 2003 Dec;17(12):2257-317. 3. Gabert J, et al. Standardization and quality control studies of 'real-time' quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia - a Europe Against Cancer program. Leukemia. 2003;17:2318-57. 4. Beillard E, et al. Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using 'real-time' quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) - a Europe against cancer program. Leukemia. 2003 Dec;17(12):2474-86. 5. Bolufer P, et al. Quantitative assessment of PML-RARa and BCR-ABL by two real-time PCR instruments: multiinstitutional laboratory trial. Clin Chem. 2004 Jun;50(6):1088-92 6. Gonzalez M,et al ; Spanish Programme for the Study and Treatment of Haematological Malignancies (PETHEMA) Group. Pretreatment characteristics and clinical outcome of acute promyelocytic leukaemia patients according to the PML-RAR alpha isoforms: a study of the PETHEMA group. Br J Haematol. 2001 Jul;114(1):99-103. 7: Bolufer P, et al Variability in the levels of PML-RAR alpha fusion transcripts detected by the laboratories participating in an external quality control program using several reverse transcription polymerase chain reaction protocols. Haematologica. 2001 Jun;86(6):570-6.