Plataforma Métodos de Investigación Preclínica

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Plataforma Métodos de Investigación Preclínica:
Generación de nuevos modelos de enfermedad, identificación de nuevas dianas terapéuticas y desarrollo preclínico de fármacos

Coordinadores:
1.- Juan Carlos Lacal. Unidad de Oncología Traslacional, Instituto
de investigaciones Biomédicas “Alberto Sols”, Madrid
2.- Atanasio Pandiella. Centro de Investigación del Cáncer, Salamanca

1. JUSTIFICACIÓN DE LA ESTRUCTURA GENERAL DEL PROGRAMA

El propósito general de este programa es ofrecer a la comunidad científica un servicio que permita trasladar a la clínica de manera rápida, eficiente, y segura nuevos fármacos que actúan, principalmente, sobre dianas celulares y aumentar su capacidad de predecir su comportamiento biológico de los distintos tipos tumorales.

En los años recientes, hemos asistido a un gran desarrollo de conocimiento acerca de los mecanismos moleculares que participan en la génesis y progresión de diferentes neoplasias, y esto ha provocado el desarrollo de fármacos que actuando sobre estas moléculas pudieran frenar el crecimiento tumoral. Ante este escenario, es imprescindible que España se posicione como país líder, y para ello es crítico que se realice un esfuerzo, uniendo investigadores clínicos y básicos comprometidos en realizar un traslado rápido de los hallazgos de laboratorio hacia la clínica. En este sentido, la reputación de los grupos que coordinan esta plataforma, representa una garantía y esta conjunción ofrece una oportunidad única para consolidar y extender la experiencia traslacional acumulada por los diferentes miembros participantes en esta Plataforma.

En esta subplataforma se contemplan tres situaciones: (A) el desarrollo de compuestos contra nuevas dianas, (B) el estudio de fármacos de nueva generación, que ya están en fase de desarrollo (por ejemplo, los inhibidores del receptor del IGF-1), pero en los que está por ver su eficacia en patologías específicas, su sinergia con otros fármacos, y su mecanismo de acción en esas patologías, y (C) generación de nuevos modelos de enfermedad. Estos tres escenarios requieren un abordaje diferente, y por ello se describen en distintos apartados.

2. FUNDAMENTOS DE LA TECNOLOGÍA/METODOLOGÍA

A. Desarrollo de fármacos nuevos

La plataforma ofrecida en esta propuesta traza el recorrido completo y continuo desde la identificación de un producto génico catalogable como una potencial diana terapéutica en cáncer, la comprobación de su actividad tumoral, su validación en muestras tumorales humanas, la identificación y el diseño de moléculas que modulen su actividad, la comprobación de los efectos sobre la misma en sistemas in vitro e in vivo, y concluye con la validación del efecto antitumoral de las moléculas identificadas en sistemas in vivo. Una última etapa, contemplada en la plataforma, consiste en la verificación de que los efectos tóxicos permiten su uso potencial en ensayos clínicos de Fase I.
Esta plataforma presenta la ventaja que dada su gran flexibilidad, permite la incorporación como usuarios de una gran diversidad de grupos a diferentes niveles, incluyendo grupos de investigación básica pura, investigación básica aplicada (traslacional), y grupos de investigación clínica orientados fundamentalmente al diagnóstico, el pronóstico y seguimiento de la respuesta al tratamiento. Por otra parte, el desarrollo de esta plataforma se realizará en estrecha colaboración con los Programas 2 (banco de tumores), 3 (genómica, proteómica y bioinformática) y 4 (diagnóstico). En una primera fase, la plataforma concentrará sus esfuerzos en la creación de una estructura de apoyo al desarrollo de nuevos fármacos antitumorales permitiendo su entrada en fase clínica, así como al diseño de nuevos tratamientos combinatorios de fármacos ya en uso clínico.

Las diferentes etapas que constituyen la plataforma en su vertiente tecnológica y que puede manifestarse tanto en su versión de asesoría como de prestación del servicio se han agrupado en 6 ámbitos de actuación concretos:

1.- Identificación de nuevas dianas terapéuticas, verificación de las alteraciones en tumores humanos y validación en sistemas in vivo
2.- Identificación, diseño, síntesis y modelización de moléculas moduladoras de la actividad de las dianas terapéuticas identificadas
3.- Análisis de actividad antitumoral de nuevos fármacos en modelos in vitro e in vivo
4.- Farmacodinámica, farmacocinética y toxicología de fármacos en sistemas experimentales
5.- “Drug profiling”: farmacogenómica y farmacogenética en sistemas experimentales
6.- Identificación de mecanismos de resistencia a fármacos en sistemas experimentales

B. Estudio de fármacos de nueva generación, su sinergia con otros agentes, y estudio de su mecanismo de acción.

En la presente plataforma se pretende estudiar de forma global la actividad de algunos de nuevos tratamientos dirigidos frente a los mecanismos básicos de generación y mantenimiento del clon tumoral.
Los principales servicios ofertados serán 1) Evaluación de la eficacia, la toxicidad y el mecanismo de acción de nuevos fármacos; 2) Análisis de combinaciones de nuevos fármacos que puedan presentar un efecto sinérgico, particularmente con aquellos que ya se encuentran en la clínica; 3) aquellos fármacos que presenten unas mejores perspectivas clínicas en los estudios in vitro se llevarán al modelo animal para estudiar los puntos señalados anteriormente.

C. Modelos animales

Los modelos animales son cruciales en el estudio de la oncogénesis y en el desarrollo de nuevos antitumorales. La generación de modelos animales que repliquen de manera más próxima el comportamiento clínico de las distintas neoplasias es esencial para incrementar nuestra capacidad trasnacional en oncología. Esta actividad potenciará la comprensión de los mecanismos patogénicos de los distintos tipos tumorales, incrementando la capacidad de predecir su comportamiento biológico y de desarrollar fármacos más efectivos frente a estas patologías. En esta plataforma se ofrece un servicio de modelos animales que pretenda dar respuesta a problemas clínicos y biológicos requeridos por los grupos de la Red. Desde este punto de vista, este servicio pretende facilitar la investigación de grupos que no posean experiencia o infraestructura para analizar, por ejemplo, el comportamiento biológico de células tumorales y/o su respuesta in vivo a tratamientos antineoplásicos. El servicio se encargará del establecimiento del modelo animal adecuado, así como del análisis in vivo del crecimiento tumoral, su capacidad metastásica, o sensibilidad a tratamientos. En este sentido, y basándonos en la integración de las diferentes áreas de esta plataforma, si fuera requerido por los investigadores, se procedería a abordar estudios mecanísticos, por ejemplo, de genes de susceptibilidad metastásica, o mecanismo de acción in vivo del fármaco objeto de estudio. Se contempla también la posibilidad de participar en el desarrollo de modelos animales para enfermedades oncológicas para las cuales no existan modelos completamente satisfactorios, como por ejemplo para la línea vertical de mieloma múltiple o la de tumores sólidos.

METODOLOGÍA DE ESTUDIO DE FÁRMACOS DE NUEVA GENERACIÓN

La metodología que se empleará seguirá el siguiente esquema general, en función de los objetivos planteados:
1) Análisis de la eficacia
Los estudios de eficacia se llevarán a cabo en diferentes tipos celulares y en diferentes situaciones., utilizando técnicas que cuantifican viabilidad (MTT) y proliferación celular (BrdU).
a. Líneas celulares de tumores sólidos y hematológicos: Se emplearán tanto líneas sensibles como resistentes a los tratamientos convencionales, si las hubiere.
b. Células aisladas de pacientes al diagnóstico y refractarios a diversos tratamientos.
c. Análisis de la eficacia de los fármacos en presencia del estroma/micromedioambiente, dada la importancia que tienen los tejidos de soporte en varios tipos de tumores.
2) Análisis de la toxicidad
Una vez conocida la eficacia antineoplásica de los fármacos se evaluará la toxicidad en células procedentes de donantes sanos, cuando sea factible. Estos estudios se llevarán a cabo mediante MTT y estudios de Anexina-V por citometría de flujo.
3) Estudio del mecanismo de acción
En todos los fármacos se analizarán las siguientes vías generales, y en cada uno de ellos se realizarán estudios complementarios en función de sus dianas biológicas específicas.
a. Estudio de la apoptosis: Se utilizarán técnicas de Anexina-V por citometría de flujo y Western-Blot para conocer las principales proteínas implicadas en la muerte celular.
b. Análisis del ciclo celular mediante citometría de flujo, y en caso de observar alguna alteración importante se analizarán las principales proteínas de ciclo celular mediante Western-Blot.
c. Estudios de vías de señalización celular: Asimismo se estudiarán mediante Western-Blot el efecto causado por el tratamiento con las drogas sobre las vías más importantes de proliferación celular como son Erk, PI3K/AKT, NFkB, JAK/STAT.
d. Estudios de farmacogenómica: Se analizarán las modificaciones producidas en el perfil de expresión génica por los fármacos que se van a estudiar. En muchos casos, estos estudios serán el punto de partida para la realización de otros estudios más específicos que delinearán mejor el mecanismo de acción.
4) Estudios combinatoriales
Se evaluarán las combinaciones de fármacos que presenten un mayor efecto sinérgico mediante las técnicas descritas. La potencial sinergia/aditividad/antagonismo se analizará mediate el programa Calcusyn (algoritmo de Chou-Talalay).Análisis de la eficacia en modelos animales
5) Análisis de la eficacia en modelos animales
Aquellos fármacos con mejores resultados “in vitro” y que tengan posibilidades de ser llevados a la clínica serán analizados en el modelo animal con los siguientes objetivos:
a. Análisis farmacocinético con el fin de conocer el perfil de absorción y eliminación de la droga. Este análisis sólo se llevará a cabo si no ha sido realizado previamente por la compañía farmacéutica.
b. Estudio de la toxicidad del fármaco in vivo y de la máxima dosis tolerada.
c. Análisis de la eficacia del fármaco “in vivo”. Mediante el estudio de la reducción de la masa tumoral y mediante un análisis de supervivencia de animales tratados frente a controles.
d. Análisis del mecanismo de acción. Tiene por objetivo corroborar los resultados obtenidos por los estudios “in vitro”.

3. GRUPOS QUE CONTRIBUYEN A LA PLATAFORMA

Dr. Juan Carlos Lacal, Unidad de Oncología Traslacional, Instituto de Investigaciones Biomédicas “Alberto Sols”, Madrid. En este grupo se centralizarían todos los ensayos relacionados con los tumores sólidos. Este grupo tiene un amplia experiencia de más de 23 años en la identificación de nuevas dianas terapéuticas en cáncer y en el desarrollo de nuevos antitumorales. Ha mantenido en los últimos años colaboraciones con empresas farmacéuticas de ámbito y relevancia internacional como Serono, Bristol-Myers Squib, Roche Pharmaceuticals, AstraZeneca, y nacionales como Laboratorios Knoll (Grupo BASF) y Pharmamar. Ha participado en la identificación de nuevas dianas terapéuticas en oncología, y en la confirmación de su actividad tumoral y metastásica. También ha participado en la identificación de inhibidores para las mismas mediante técnicas de screening, en el diseño y síntesis de nuevas moléculas inhibidoras para las dianas identificadas, incluyendo el ensayo de su actividad in vitro e in vivo. Ha participado en el estudio de la actividad in vivo de los nuevos fármacos sintetizados por técnicas de inmunohistoquimica, PCR cuantitativa, arrays de varias plataformas (Affymetrix, Consorcio Compugen, Code Link y tarjetas microfluídicas de Applied Biosystems), RMN, etc, así como la identificación de mecanismos de acción y sistemas de resistencia. Por último, participa en sistemas de expresión de proteínas oncogénicas en sistemas recombinantes, su purificación y cristalización para el modelado de nuevas moléculas inhibidoras.

Dr. Atanasio Pandiella, Centro de Investigación del Cáncer (CIC), Salamanca. En este grupo se centralizarían todos los ensayos relacionados con los tumores hematológicos. Este grupo, en colaboración con el Servicio de Hematología del Hospital Clínico Universitario de Salamanca ha realizado varios trabajos sobre la caracterización del efecto antineoplásico de diferentes fármacos de nueva generación, como el bortezomib, Glivec, o los inhibidores de histona deacetilasas, y trabaja de forma permanente en el estudio de nuevas dianas moleculares en tumores hematológicos y sólidos, con especial énfasis en la identificación de vías de señalización que participan en la proliferación de células tumorales. En la actualidad, este grupo de investigación mantiene un portfolio de fármacos de nueva generación que se pondrá a disposición de los grupos de la red interesados para su análisis en las patologías que ellos consideren oportunas, como parte de los servicios ofrecidos. Este servicio debe realizarse, por supuesto, con el beneplácito de las compañías suministradoras, a las cuales el grupo del CIC presentará una propuesta de trabajo para su estudio y aprobación.

Los servicios de modelos animales serán aportados fundamentalmente por el siguiente grupo:

El Dr.Fernando Martín Lara (Grupo del Dr. Carlos Suarez), Grupo de Investigación en Oncología Quirúrgica. Miembros de este grupo pertenecen al laboratorio de transgenesis del IUOPA. Darán servicio a los grupos de la RTICC utilizando modelos animales knock out y transgénicos con fenotipo tumoral para el estudio molecular de la oncogénesis y de la respuesta a antitumorales. Este laboratorio fue creado en septiembre de 2005, y lleva a cabo manipulación genética de embriones de ratón para generar ratones modificados genéticamente, que pueden ser utilizados para ensayos farmacodinámicos y farmacocinéticos, una vez identificada y validada la diana molecular. Además, el grupo tiene experiencia en la determinación de alteraciones moleculares con valor diagnóstico y pronóstico en carcinoma epidermoide de cabeza y cuello.

4. PROGRAMA Y ESTRATEGIA DE TRABAJO.

Una encuesta preliminar realizada entre los grupos admitidos a ser integrantes de la red ha permitido identificar un total de 35 grupos (33% de la red) interesados en diferentes aspectos preclínicos y del desarrollo de nuevos fármacos del programa. De éstos, 26 se han identificados como usuarios potenciales de servicios y 21 como usuarios de asesoramiento. La prestación de servicios como plataforma se pone en marcha con dos grupos que centralizarán todas las actuaciones de forma integral en sus facetas de tumores hematológicos y tumores sólidos, y con una estrecha colaboración entre ambos que permita una coordinación fluida de toda la plataforma preclínica, y tres grupos de modelos animales. Además se dispondrá de la prestación de servicios de tres grupos con actividad complementaria en diferentes aspectos del uso de modelos animales.
Existen dos aspectos que estratégicamente serán abordados por la plataforma: (i) actuar como servicio de análisis de fármacos de nueva generación para aquellos grupos que lo soliciten, tanto a nivel de la efectividad del fármaco en una patología requerida (utilizando los ensayos in vitro e in vivo mencionados), como a nivel del estudio de su mecanismo de acción: y (ii) identificar proyectos traslacionales presentados por grupos de la red con objeto de potenciar su desarrollo.

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